血清是细胞培养中仅有外源添加的成分不确定的物质,血清的质量对实验成败起着关键性作用,但血清使用不当也可能会导致血清质量下降,造成细胞培养效果不理想。BioChannel来给大家聊聊血清使用中的一些疑惑,帮助大家理清头绪,实验开展顺顺利利。
血清的主要成分
血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已知,但还有一部分尚不清楚,且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等,这些物质对促进细胞生 长或抑制生长活性是达到生理平衡的。对血清的成分和作用的研究虽有很大进展,但仍存在一些问题。主要是:
第一:血清的成份可能有几百种之多,目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚,尤其是对其中一些多肽类生长因子、ji素和脂类等尚未充分认识,这给研究工作带来许多困难;
第二:血清都是批量生产,各批量之间差异很大,因此,要保证每批血清的相似性极为困难,从而使实验的标准化和连续性受到限制;
第三:不能排除血清中含有易变物质,这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。
血清储存以及解冻注意事项
1、需要长期保存的血清必须储存于-20℃ 至- 70℃ 低温冰箱中,4℃冰箱中保存时间切勿超过一个月,由于血清结冰时体积会增加约10%,因此,血清在冻入低温冰箱,必须预留定体积空间(强调),否则易发生污染或玻璃瓶冻裂。、
2、瓶装血清解冻需采用逐步解冻法:-20℃ 至 -70℃ 血清低温冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1天,然后移入室温或者可以置于37℃水浴中,不断摇动待全部溶解后再分装。在溶解过程中需不断轻轻摇晃均匀(小心勿造成气泡),使温度与血清成分均一,减少沉淀的发生。切勿直接将血清从-20℃进入37℃解冻,因温度改变太大,容易造成蛋白质凝集而出现沉淀。
若一次无法用完一瓶,无菌分装血清至恰当的灭菌容器内,再放回冷冻。
血清化冻为什么是浑浊的?
血清制备过程中会保留部分纤维蛋白原,化冻过程中纤维蛋白原可转化为纤维蛋白,使血清中出现浑浊,絮状物。这种情况不影响血清的功效。血清化冻过程中,在37℃水浴中放置时间过长,也会导致沉淀产生,沉淀物包含磷酸钙结晶。沉淀物也不影响血清功效。
去除方法:可以将血清分装至无菌离心管内,以400g 稍微离心,将上清液加入培养基内一起过滤。也可直接过滤血清以去除这些絮状物。
血清热灭活(除非必须,一般不建议作此热处理)
1、血清为何要灭活
血清热灭活是将血清置于56℃水浴至完全解冻。可灭活其中补体系统中具有蛋白酶活性的成分。补体是免疫系统的成分。对于那些培养困难的细胞、用于病毒检测的细胞、用于细胞毒性检测很重要,可避免补体带来的不利影响。单热灭活也破坏血清中的生长因子,所以除非必需,血清才灭活处理。
启动的补体参与溶解细胞事件,刺激平滑肌收缩,细胞和血小板释放组胺,启动淋巴细胞和巨噬细胞活化。在免疫学研究、培养ES 细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。
2、血清灭活的正确方法
(1) 按照前面的介绍正确化冻
(2) 水浴预热56℃。水量要足够,水深要超过瓶中血清的高度。
(3) 轻轻摇动已解冻的血清,置于水浴中,水位可能会下降。
(4) 待水温重新到56℃时,再计时30分钟。
(5) 从水浴中拿出血清,待冷却。-20/-70℃存放。
目前市面上的血清产品五花八门,各种品牌宣称来自各个血源地,让人眼花缭乱。它们当中绝大多数都是质量合格的产品。但合格不一定好用,或者说适用于某一种细胞。要确定一款血清的性能,或者从众多血清来源中挑选一款,筛选验证才是好的验证方法。
血清的筛选验证主要包括:形态验证、增殖能力测试和克隆形成能力测试。我们通过多次传代,分辨同细胞、同代次、不同血清样品培养的细胞形态间的细微差异;或者同血清样品、不同细胞、不同代次间,细胞形态维持的情况。我们通过同一细胞多次传代,每代接种相同细胞量,间隔相同时间后计数得到单位时间倍增数,确定增殖性能。又通过不同细胞在相同培养面积内接种相同的少量的细胞,根据形成的单克隆数量、大小,判断血清支持克隆形成的能力。
一款血清需要综合达到这几个性能的高水平表现,才能称为好血清。适合的才是好的血清。
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